Дж. Гринштейн
М. Виниц
Химия аминокислот
и пептидов
*** 1965 ***
От нас: 500 радиоспектаклей (и учебники)
на SD‑карте 64(128)GB — ГДЕ?..
Baшa помощь проекту:
занести копеечку — КУДА?..
|
HEKOTOPЫЕ БECCИCTEMHO И HEУBEPEHHO PACПOЗHAHHЫE ФPAГMEHTЫ КНИГИ
Амиды и эфиры описаны главным образом в форме соответствующих ацетатов или галогенгидратов, и лишь иногда — в виде свободных оснований, а также пикратов, сульфатов, пикролонатов или других солей; пептиды, содержащие остаток основной аминокислоты (аргинина, лизина или гистидина), также обычно описаны в виде солей с органическими и неорганическими кислотами.
44. Каталитический гпдрогенолиз. Принцип. Восстановительное действие водорода в присутствии таких катализаторов, как палладиевая чернь, палладированный уголь или окись палладия, может быть использовано для легкого отщепления бензильной группы, связанной ковалентной связью с атомами кислорода, азота и в некоторых случаях серы. Эта реакция с успехом была использована для количественного отщепления карбобензоксигруп-пы, соединенной амидной связью с а-аминогруппой соответствующего производного аминокислоты пли пептида (I —»¦ IV; X = Н). В ходе этой реакции бензильный остаток элиминируется в виде толуола (II; X = Н) с одновременным выделением двуокиси углерода (III), по-видимому, в результате спонтанного распада неустойчивых промежуточных N-карбоксиаминокислот [128]. Аналогично проводят деацилирование и в тех случаях, когда карбобенз-оксигруппа служит защитой гидроксильной функции остатка оксиамино-кислоты, например тирозина [826], а также ш-аминогруппы диаминокислоты (например, лизнна [626]) или гуанидиновой группировки аргинина [459, 904, 905]. Такого же рода восстановительная деградация может быть использована в случае n-нитрокарбобензокси- (I; X = N02) [363, 462], п-бромкар-бобензокси- (I; X = Вт) [461], n-хлоркарбобензокси- (I; X = С1) [514], а также карбофенокси-(С6Н 5—ОСО—) [514] и карбо-и-толилоксп- (п-СН3С6Н4 —ОСО—) [514] производных; поскольку в случае и-нитрокарбобензоксп-производных эта реакция протекает с одновременным восстановлением нитрогруппы в аминогруппу, то здесь одним из продуктов реакции является n-толуидпн (II; X = NH2),a не «-нитротолуол (II; X = N02) [462]. Каталитический гидрогенолиз может быть использован также для отщепления карбо-аллилокси- (СН2=СНСН2—ОСО—) [460] и тритильной ](СвН5)3С—] [548] групп. В случае карбоаллилоксигруппы метод гидрогенолиза имеет ряд недостатков, поскольку прп этом происходит одновременное гидрирование аллильного остатка до устойчивого к гидрогенолизу пропильного остатка, что, естественно, понижает выход выделяемого продукта реакции [460, 514]. С другой стороны, редуктивное отщепление тритильной группы в виде трпфенилметана [(С611Г,);(СН] протекает количественно, однако скорость гакой деградации значительно ниже, чем у соответствующих карбобензокси-производных [548, 843]. Если бензпльная группа связана с остатком аминокислоты простой эфирной связью (например, в 0-бензилсерине [504, 828, 829, 984] и О-бен-зилтирозине [830]), сложноэфирной связью, как в случае сложных бензило-вых эфиров [602, 705], или же непосредственно с аминогруппой (в N°-6en-зиламинокислотах [551, 552,555, 565]), то гидрогенолиз приводит к появлению свободной гидроксильной (V—*-VI), карбоксильной (VII - VIII) или аминогруппы (IX - X) соответственно. В то время как н-нитробензильная группа, соединенная тиоэфирной связью с сульфгидрильной функцией остатка цистенна (XI; X = N02), отщепляется сравнительно легко, в случае аналогичного производного с незамещенной бензильной группой (XI; X = Н) в тех же условиях не наблюдается заметного расщепления [512]. Наконец, следует отметить, что катализируемый палладием гидрогенолиз позволяет удалить нитрогруппу с остатка нитроаргинина (XIII) в конечной стадии синтеза пептидов аргинина; по-видимому, эта реакция протекает с первоначальным образованием промежуточного производного гидразина (XIV), которое, в свою очередь, претерпевает дальнейшую деградацию с образованием производного аргинина (XV) и одной молекулы аммиака (XVI) [492]. Экспериментальные условия. Отщепление карбобензокси-, n-нитрокар-бобензокси-, и-бромкарбобензокси-, и-хлоркарбобензокси-, карбофенилокси-и карбо-м-толилоксигрупп, соединенных с атомом кислорода или азота, может быть осуществлено каталитическим гидрогенолизом при комнатной температуре и атмосферном давлении. В каждом из этих случаев реакция протекает с поглощением 1 моля водорода и выделением 1 моля двуокиси углерода на 1 моль ацильного заместителя (за исключением /г-нитрокарбобенз-оксигруппы, в случае которой требуется поглощение еще 2 молей водорода для восстановления нитрогруппы в аминогруппу). В качестве катализатора до сих пор наиболее успешно использовалась палладиевая чернь, хотя удовлетворительные результаты были получены н при применении окиси палладия, а также 5—20% палладия на угле. Высокоактивная палладиевая чернь может быть получена путем восстановления раствора хлористого палладия муравьиной кислотой согласно приводимой ниже методике 157; поскольку активный катализатор является пирофорным и в высушенном состоянии инактивируется, его целесообразно хранить под водой. Хотя препарат 10% палладия на угле в настоящее время имеется в продаже, его активность, по данным автора, значительно колеблется от партии к партии, ввиду чего применять этот катализатор обычно не рекомендуется. С другой стороны, в последнее время получены удовлетворительные результаты при использовании вместо палладиевой черни окиси палладия; последнюю легко получить путем температурно-контролируемого сплавления хлористого палладия с нитратом натрия (методика 158). Однако независимо от типа применяемого катализатора, гидрогенолиз может проводиться пли в специальной аппаратуре, или в аппаратуре, легко собираемой из обычного оборудования химической лаборатории. Вследствие крайней чувствительности палладиевого катализатора к отравлению следами серы предпочтительна полностью стеклянная аппаратура, хотя, вообще говоря, могут быть использованы резиновые пробки и шланги, "если последние предварительно десульфуризованы путем обработки 10—20%-ной щелочью в течение недели с последующей многократной промывкой дистиллированной водой до нейтральной реакции на лакмус. Аппаратура, которая с успехом была использована в лаборатории автора, изображена на рис. 27 (см. методику 159). Во всяком случае, при использовании любой аппаратуры следует обеспечить возможность пропускания через систему тока чистого водорода и удобного определения двуокиси углерода, выделяющейся в процессе гидрогенолиза. Типичная методика 157 [986]. Палладиевая чернь. Пластинку металлического палладия (12 г) нарезают тонкими полосками длиной 1—1,5 см и помещают в колбу Кьельдаля емкостью 500 мл, содержащую 50 мл «царской водки» (1 часть концентрированной азотной кислоты на 3 части концентрированной соляной кислоты). Смесь оставляют при комнатной температуре на 10—15 мин и после этого нагревают на паровой бане сначала осторожно, а затем более энергично, до полного растворения металла. Раствор выпаривают досуха на парафиновой бане при 130—140°, остаток обрабатывают 30 мл концентрированной соляной кислоты и смесь вновь выпаривают досуха. Обработку соляной кислотой и выпаривание повторяют еще дважды, остаток растворяют в 60—100 мл 5 н. соляной кислоты и раствор фильтруют в колбу Флоренса емкостью 5 л, содержащую 1200 мл нагретой до 90° воды. К горячему раствору при интенсивном и непрерывном перемешивании медленно добавляют 3,6 мл муравьиной кислоты и затем при энергичном встряхивании прибавляют порциями 5 н. раствор едкого кали до щелочной реакции на лакмус (около 200 мл). После этого добавляют по каплям муравьиную кислоту до слабощелочной реакции (по лакмусу), смесь охлаждают проточной водой, зернистый осадок палладиевой черни отделяют декантацией и 8—9 раз промывают дистиллированной водой. Катализатор, готовый к употреблению, хранят под слоем дистиллированной воды в плотно закрытом сосуде; ни в коем случае не следует высушивать катализатор досуха. Поскольку катализатор легко отравляется следами серы, необходимо избегать его контакта с серусодержащнми материалами (резиновыми пробками, шлангами и т. п.), а также с некоторыми газами, иногда присутствующими в лабораторном воздухе, например с сероводородом. Типичная методика 158 [987]. Окись палладия {катализатор). В фарфоровой чашке емкостью 150 мл тщательно смешивают 50 г химическп чистого нитрата натрия и раствор хлористого палладия (содержащий 2 г палладия), смесь выпаривают досуха и затем нагревают до плавления. Смесь плавится при 270—280° и, когда температура достигает 350—370°, наблюдается интенсивное выделенпе окпслов азота, сопровождающееся значительным вспениванием. Когда выделение газов закончится (на это требуется 3—5 мин), температуру быстро повышают и поддерживают в интервале 575—600° в течение 5 мин. Поскольку резкое повышение температуры может сопровождаться интенсивным выделением газов, рекомендуется нагревать смесь на одной горелке Меккера. Затем расплав охлаждают, растворяют в 200 мл дистиллированной воды и окнсь палладия отфильтровывают. Вследствие того что окись палладия в чистой воде может легко давать коллоидные растворы, катализатор не следует промывать водой; ввиду этого его тщательно промывают 1%-ным раствором нитрата натрия и высушивают в вакуум-эксикаторе над серной кислотой. В целом, включая фильтрование и промывку, для приготовления катализатора требуется около 45 мин. Если все операции выполнены правильно, фильтрат от окиси палладия должен быть прозрачным и бесцветным. Нитрат и хлорид палладия в концентрированных растворах дают темно-коричневую окраску, которая при разбавлении становится слабо-желтой, и эта окраска может быть использована как показатель полноты осаждения. Если же фильтрат обнаруживает желтооранжевую опалесценцию, то, следовательно, некоторая часть окиси палладия перешла в коллоидное состояние. Для регенерирования палладия из фильтрата последний можно или выпарить досуха и затем переплавить, или путем добавления карбоната натрия довести до слабощелочной реакции и осадить палладий путем нагревания с формальдегидом. Небольшие количества окиси палладия, как правило, прилипающие к фарфоровой чашке в процессе сплавления и не удаляемые обычными способами, могут быть легко растворены в кипящей бромистоводородной кислоте Практически каталитическое восстановление соответствующих N-аци-лированных пептидов обычно проводят в безводных или водных растворах метанола, этанола, ледяной уксусной кислоты или в других подходящих растворителях; кроме того, эту реакцию ускоряет добавление нескольких капель ледяной уксусной кислоты. Типичные приемы, используемые при превращении N-карбобензоксипептидов в соответствующие свободные пептиды, описаны в методике 159; эта методика, естественно, применима для гидрогенолиза производных, содержащих л-нитро-, «-хлор- и п-бромкар-бобензокси-, а также карбофенилокси- и карбо-я-толилоксигруппы. Как указано в методпке, для снятия карбобензоксигруппы требуется около 2 час, хотя это время может изменяться весьма значительно в зависимости от активности и количества применяемого катализатора, температуры, давления и ряда других факторов. Во всяком случае, конец реакции может быть легко определен по прекращению выделения углекислого газа. Поскольку реакция протекает количественно с образованием летучих побочных продуктов (толуола и двуокиси углерода), то последующее упаривание растворителя в вакууме сразу приводит к достаточно чистому пептиду. Следует учитывать, что приводимая здесь методика гидрогенолиза имеет ряд других модификаций (см., например, методику 160). Типичная методика 159. Каталитический гидрогенолиз карбобензокси-пептидов. В реакционную колбу (рис. 27) помещают суспензию, содержащую около 1 г палладиевого катализатора (методика 157) и катализатор несколько раз промывают метанолом путем декантации. Затем в колбу добавляют раствор 0,02 моля соответствующего карбобензоксипептида в метаноле, содержащий 4—5 капель ледяной уксусной кислоты. Нижний конец газоприводной трубки регулируют таким образом, чтобы он находился чуть выше поверхности раствора. С целью предосторожности против возможного взрыва смеси кислорода с водородом необходимо внимательно следить за тем, чтобы катализатор не оставался на стенках колбы и не находился выше поверхности раствора. Убедившись в герметичности всех узлов прибора, через систему в течение 5 мин пропускают умеренный ток водорода (без перемешивания реакционной смеси) для вытеснения атмосферного кислорода; скорость пропускания газа контролируют путем использования газопромывной склянки с дистиллированной водой (выходящие газы должны отводиться наружу через противовзрывной чехол или в открытое окно, причем следует устранить возможность их контакта с голым пламенем или искрой). После этого реакционную смесь начинают перемешивать магнитной мешалкой, и выходящие газы периодически контролируют на наличие в ннх двуокиси углерода путем пропускания через насыщенный раствор гидроокиси бария; образование белогх» осадка карбоната бария свидетельствует о-начале реакции. Такой контроль проводят каждые 30 мин до окончания гидрогенолиза, что определяют по прекращению выделения углекислого газа. Если в процессе гидрогенолиза выпадает осадок свободного пептида, необходимо добавить воду до полного растворения осадка. После окончания реакции катализатор отфильтровывают, промывают небольшим количеством воды и объединенные фильтрат и промывные воды концентрируют в вакууме при 40°. Рис. 27. Аппарат для каталитического гидрирования. А — трубка для ввода водорода; В — трубка для отвода газов; С — реакционная колба; D — газопромывная склянка; Е — магнитная мешалка. Полученный пептид перекрнсталлизовывают из водного спирта или из другого подходящего растворителя. Типичная методика 1С0 [610]. а-Ь-Глутамил-Ь-валин. Раствор 0,7 г карбобензокси-а-Ь-глутамил-Ь-валина (см. методику 150) в водном метаноле каталитически гидрируют в условиях методики 159. Полученный пептид, выпадающий в процессе восстановления, после окончания гидрогенолиза отфильтровывают вместе с катализатором, твердое вещество экстрагируют кипящей водой и продукт реакции высаживают нз водного раствора этанолом; блестящие пластинки, выход 0,45 г. Перекристаллизацию проводят из водного этанола; [ajfe5 + 24,5° (2,7% в воде, содержащей 1 эквивалент соляыой кислоты). Приложение описанной выше схемы гидрогенолиза к метиловым и этиловым зфирам, а также амидам соответствующих №-ацилированных пептидов требует добавления к реакционной смеси по меньшей мере 1 эквивалента кислоты (обычно соляной или уксусной) на 1 молярный эквивалент образующейся аминогруппы. Получающиеся эфиры пептидов (методика 161) или амиды пептидов (методика 162) выделяют затем в виде соответствующих хлоргидратов или ацетатов, хотя обычно рекомендуется использовать ацетаты вследствие их большей склонности к кристаллизации [9161. Однако если каталитическому гидрогенолизу подвергаются бензиловые эфиры пеп- тидов, то реакция протекает с одновременным отщеплением Лт-ацильного и~С-бензильното остатков и образованием свободного пептида(методика 103); как правило, используют 0,5 г палладиевого катализатора на 0,01 моля восстанавливаемой группы. Поскольку отщепление бензильной группы сложных бензиловых эфиров не сопровождается выделением газообразной двуокиси углерода, в этом случае представляется целесообразным использовать аппаратуру для гидрирования, позволяющую контролировать ход реакции по количеству поглощенного водорода или же примерно вдвое увеличить время гидрогенолиза, необходимое для полного удаления карбобензоксигруппы. То же самое имеет место при отщеплении бензильной группы, соединенной простой эфирной связью с гидроксильной функцией остатка серина или треонина, а также в случае бензильной группы, связанной непосредственно с атомом азота аминогруппы, и /г-нитробензильной группы, соединенной тио-эфирной связью с сульфгидрильной функцией. В первых двух случаях расходуется 1 моль водорода на моль отщепляемой бензильной группы, в то время как для редуктивного отщепления S-n-нитробензильного остатка требуется 3 моля водорода по следующей реакции [5121: Поскольку восстановительное отщепление нитрогруппы в случае производных нитроаргинина (методика 164) и тритильной группы в случае производных N-тритиламинокислот происходит значительно медленнее, чем отщепление О- или N-бензильной группы, то в первом случае для гидрогенолиза обычно требуется несколько больший период времени. Типичная методика 161 [928]. Ацетат этилового эфира глицил-Ь-тиро-зина. К раствору 2 г этилового эфира карбобензоксиглицил-Т.-тирознна (методика 80) в 25 мл абсолютного метанола добавляют 1,2 молярного эквивалента ледяной уксусной кислоты, и смесь каталитически гидрируют в условиях методики 159. После окончания восстановления смесь фильтруют, катализатор промывают небольшим количеством метанола и объединенные фильтрат и промывные воды выпаривают в вакууме досуха при температуре не выше 40°. Остаток обрабатывают эфиром и кристаллический продукт реакции отфильтровывают: выход 1,5 г; [а]ц + 16,2° (2% в воде). Типичная методика 162 [916]. Ацетат глицпл-Ь-тирозинамида. Раствор 1,85 г карбобензоксиглицил-Ь-тирозинамида (методика 147) и 0,3 мл ледяной уксусной кислоты в 25 мл метанола каталитически гидрируют в условиях методики 159. После завершения реакции катализатор отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме при температуре не выше 40е и получают 1,4 г кристаллического продукта, который перекристаллнзовывают из смеси метанола с этилацетатом; [сс)о + 28,0° (10% в воде). Типичная методика 163 [904]. Дипикролонат Ь-аргинил-П-аргишша. Суспензию 4,78 г бензилового эфира N“, N“, №\-трикарбобензокси-1.-арги-нил-Мш-карбобензокси-Ь-аргинина (методика 120) в 150 мл метанола, содержащего 2—3 м.г уксусной кислоты, каталитически гидрируют согласно методике 159. Реакционную смесь фильтруют, катализатор несколько раз промывают 5%-ной уксусной кислотой, и объединенные фильтрат и промывные воды снова фильтруют. Фильтрат разбавляют водой до объема 300 мл; каждый миллилитр полученного раствора содержит приблизительно 5,5 мг аргиниларгинина. Аликвотную часть этого раствора (200 мл) концентрируют в вакууме до густого сиропа при температуре не выше 40°, добавляют небольшое количество воды, г.месь-снова упаривают и эту операцию повторяют еще раз. К раствору оставшегося сиропа в 50 мл воды добавляют 500 мл насыщенного раствора пикролоновой кислоты (полученного путем перемешивания 5,5 г перекристаллизованной из горячего этанола пикролоновой кислоты в 500 мл воды при комнатной температуре в течение ночи и отфильтровывания нерастворившегося вещества). Почти немедленно выпадает ярко-желтый осадок дипикролоната; смесь оставляют в темноте на 12 час, осадок отфильтровывают, промывают холодной водой до получения бесцветного фильтрата и высушивают на воздухе в темноте; выход 2,25 г (79%), [а!Ь5 + 5,5° (1% в диметилформамиде). Типичная методика 164 [845]. Ь-Аргинил-Ь-глутаминовая кислота. К смеси 40 мл метанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 5 мл воды добавляют 1,99 г дибензилового эфира карбобензоксинитро-Ь-аргинил-Ь-глутами-новой кислоты (методика 116), и реакционную смесь каталитически гидрируют в течение 10 час в условиях методики 159. Затем катализатор отфильтровывают и фильтрат концентрируют в вакууме досуха при температуре ниже 40°. Остаток обрабатывают абсолютным этанолом, фильтруют и затем кристаллизуют из 50 %-ного этанола. Продукт реакции представляет собой тетрагидрат; выход 0,99 г (88%), [a]fj + 20,9° (2% в воде). Облаять применения и ограничения. Карбобензоксигруппа со времени ее введения Бергманом и Зервасом [128] в 1932 г. использовалась в качестве N-защитноп группы для синтеза гораздо большего числа пептидов и их производных, чем все другие защитные группы, вместе взятые. Выдающееся место, занимаемое этой группой в синтетической пептидной химии, обусловлено главным образом легкостью ее отщепления каталитическим гидрогено-лизом в очень мягких условиях, исключающих возможность разрыва крайне лабильных пептидных связей или рацемизации оптически активных компонентов; кроме того, в этом случае единственными конечными продуктами восстановления являются соответствующий пептид (или его производное) н летучие побочные продукты, не загрязненные неорганическими солями, столь характерными для пептидных препаратов, полученных ранними методами. Поскольку гидрогенолиз протекает количественно, выход желаемого продукта реакции, как правило, колеблется в пределах 80—90% теории или является еще более высоким. Другое достоинство этого метода заключается в том, что гидрогенолиз метиловых или этиловых эфиров карбобензоксипеп-тидов ведет к соответствующим свободным эфирам пептидов и поэтому позволяет легко получать такие промежуточные соединения, которые могут быть использованы для удлинения пептидной цепи. Поскольку применение в подобной реакции бензпловых эфиров карбобензоксипептидов приводит к одновременному отщеплению N-карбобензокси- п эфирной бензильной групп, то в случае синтезов, направленных на получение свободного пептида, отпадает необходимость в стадии омыления. И действительно, вследствие высоких выходов продуктов реакции, а также доступности бензиловых эфиров аминокислот (раздел 23) часто данный путь синтеза оказывается наиболее предпочтительным. Хотя в последние годы появилась тенденция к преимущественному использованию других N-ацильных групп, близких карбобен-зоксигруппе (n-нитро-, n-хлор- или и-бромкарбобензокси-, карбоаллилокси-, карбофенилокси- и карбо-и-толилоксигруппы), все же благодаря многолетнему опыту использования карбобензоксигруппы, она в большинстве случаев практически незаменима. Хотя карбобензоксигруппа сыграла неоценимую роль в создании методов, позволяющих легко нолучать-неизвесг-ныо иливесьма труднодоступные ранее иеитиды, тем не менее все прежние попытки использовать ее для синтеза цистинсодержащих пептидов оказывались безуспешными. Так, в 1934 г. Уайт [861] сообщил о попытке декарбобензоксилирования бис-карбобензо-ксицистинил-бис-глицина путем восстановления водородом в присутствии платиновой или палладиевой черни. Несмотря на то, что цистин может быть восстановлен до цистеина путем катализируемого палладием гидрогенолиза [988], в настоящее время обычно считают, что эффективность палладиевого или платинового катализатора значительно снижается в присутствии серы. Тем не менее каталитическое гидрирование может быть использовано для количественного отщепления карбобензокспгруппы в производных пептидов, содержащих остаток метионина, что было показано Деккером, Тейлором и Фрутоном [627]; правда, в этом случае для полного завершения гидрогенолиза необходимы длительное время и периодическое добавление свежего катализатора в процессе восстановления. В случае же карбобензоксипро-изводных, содержащих дисульфидную связь, как в цистине, тноэфирную связь (в S-бензилцнстеине) или сульфгидрпльную функцию, как в цисте пне, успешного использования аналогичных приемов не описано. Однако, как было показано Берсе, Буше и Питом [512], при замене в таких соединениях карбобензокспгруппы на /i-нитрокарбобензоксигруппу путем гидрогенолиза удается легко отщепить N-ацильный заместитель; этот факт связан, по-видимому, со значительной лабнлизацией соответствующей N-ацильной связи в результате сильного индуктивного эффекта нитрогруппы. Так, гидрирование водного раствора натриевой соли бис-(и-нитрокарбобензокси)-Б-ци-стина или соответствующих цистиновых пептидов в присутствии палладиевой чернп прп комнатной температуре и атмосферном давлении приводит к соответствующим производным цистина или цистеина в зависимости от того, останавливается ли реакция после поглощения 6 или 7 молей водорода; в каждом из этих случаев побочным продуктом реакции является н-толилгид-роксиламин (п-СН3—С6Н4—NHOH). При использовании же в качестве растворителя этанола происходит поглощение только 4 молей водорода и из реакционной смеси осаждается цистин или соответствующий цистиновый пептид. Интересно, что большая чувствительность к гидрогенолизу, проявляемая n-нитрокарбобензоксигрупиой в сравнении с карбобензоксигруппой, не является характерной для других аналогичных защитных групп, скорости расщепления которых следуют в таком порядке: карбобензоксп-и-хлор -карбобензокси- карбофенилокси- карбо-п-толилокси- [514]. 45. Химическое восстановление. Принцип. Редуктивное действ по металлического натрия в жидком аммиаке на карбобензоксипептиды (I; R = OH) или их амиды (I; R = NH2) приводит к отщеплению N-ацильного заместителя и образованию нужного производного пептида (II) [690]; расщепление кар-бобензоксигруппы сопровождается образованием дибензила (III) наряду с небольшими количествами толуола (IV) [690, 989]. Аналогичным образом может быть осуществлено восстановительное отщепление О- или К-гозильной [446, 842], N-карбоаллилокси- [460] и N-бен-зилсульфонильной [601] групп; кроме того, отщепление последней группы можно осуществить действием никеля Ренея в 80%-ном этаноле в присутствии щелочи [601]. Приложение метода восстановления натрием в жидком аммиаке к производным, содержащим дисульфидную связь (V) 1690, 862, 867J, тиобензильную связь (Vi) [11, 690, 862] шли й-карбобензоксигруппу (VII) [365] (соответственно в цистине, S-бензилцистеине пли S-карбобензо-ксицистеине) приводит в каждом случае к появлению свободной сульфгид-рильной функции (VIII). При восстановительном действии натрия в жидком аммиаке происходит также легкое отщепление бензильной группы, связанной с имидазольным ядром (в 1-бензилгистидине) [842]. Экспериментальные условия. Редуктивное отщепление N- или S-карбо-бензокси-, О- или N-тозильной, N-карбоаллилокси-, N-бензилсульфониль-ноп, X- или S-бензильной групп, а также расщепление дисульфидной связи остатка цистина легко осуществляется путем обработки раствора соответствующего соединения в жидком аммиаке небольшими кусочками металлического натрия; хотя в этом отношении не существует никаких жестких правил, практически наиболее подходящей концентрацией является 0,01 моля реагента на 100—200 мл жидкого аммиака. Реакцию, как правило, проводят в сосуде Дьюара или в обычной трехгорлой круглодонной колбе с внешним охлаждением (или без него), но при интенсивном перемешивании реакционной смеси. Окончание реакции восстановления определяется по появлению устойчивой синей окраски, свидетельствующей о наличии избытка натрия. Разрушение избытка натрия, сопровождающееся исчезновением синен окраски, достигается путем добавления к реакционной смеси достаточного количества аммониевой соли, например хлорида аммония или ацетата аммония. Остаток после упаривания аммиака представляет собой смесь необходимого продукта реакции с большими количествами натриевых солей; в случае восстановления соединений, содержащих N-тозильную и, вероятно, также бензилсульфонильную группы в качестве побочных продуктов реакции образуются сульфит- и сульфат-ионы [890]. Здесь уместно отметить, что не существует никакого общего метода, позволяющего изолировать из такой реакционной смеси аминокислоты, пептиды и их амиды. Часто проблема выделения может быть решена путем использования некоторых специфических свойств продукта реакции, таких, как способность образовывать нерастворимые пикраты [842] или ртутные соли [11, 473], хотя общая применимость этих методов, по-видимому, ограничена. В большинстве случаев, однако. неорганические соли удаляются перед выделением продукта реакции. Для этой цели весьма перспективным представляется использование ионообменных смол [435, 890] и противоточного распределения (ср. с работой 1821), хотя может оказаться эффективным и применение более классических методов. Так, например, значительно большая растворимость в спирте йодистого натрия в сравнении с обычными пептидами позволяет удалить из реакционной смеси ионы натрия после ее обработки иодистоводородной кислотой; с другой стороны, отделение сульфат- и хлорид-ионов может быть достигнуто осаждением соответственно ионами бария или серебра. Во всяком случае, ясно, что применяемые методы выделения продукта реакции могут меняться в зависимости от конкретных обстоятельств. Метод, оказавшийся удовлетворительным на ряде примеров, подробно приводится в методике 165; поскольку жидкий аммиак обладает очень сильным разъедающим действием на кожу и глаза, необходимо всегда в качестве средства первой помощи иметь под рукой насыщенный раствор борной кислоты. Типичная методика 165 [890]. ct-L-Глутамилглицин. В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой осушигельной трубкой с гранулированным едким натром, помещают 3,58 г (0,01 моля) тозил-а-Ь-глутамилглицина (методики 143 и 154) и затем осторожно добавляют около 120 мл жидкого аммиака. К полученному раствору при интенсивном перемешивании постепенно добавляют небольшими кусочками (около 0,1 г каждый) металлический натрий до устойчивой темно-синей окраски (сохраняющейся в течение более 3 мин), что свидетельствует об окончании реакции; на это расходуется приблизительно 1,3—1,5 г (0,055—0,065 г.-атом) натрия. Затем к раствору добавляют ацетат аммония до исчезновения синей окраски, и смесь непрерывно перемешивают до полного самопроизвольного испарения аммиака. Последние следы аммпака удаляют путем эвакуирования колбы на водоструйном насосе при температуре 40’. Сухой остаток растворяют в 20 мл ледяной воды и обрабатывают 10 г ионообменной смолы амберлит IRC-50 (в NHj-форме). Через 30 мин смолу отфильтровывают, промывают водой, и объединенные фильтрат и промывные воды упаривают в вакууме при температуре не выше 40° до объема 15 мл. К оставшемуся раствору добавляют 1 М раствор ацетата бария (около 5—10 мл) до полного осаждения; осадок отфильтровывают, промывают холодной водой и объединенные фильтрат и промывные воды, в случае необходимости, снова упаривают в вакууме до объема 10—30 мл. Раствор наносят на колонку (размером 3x8 см), наполненную крупнозернистым ионообменником (амберлит IRC-50 в NHJ-форме); колонку промывают дистиллированной водой (скорость элюирования 20—30 капель в минуту) до тех пор, пока объем элюата не составит 150 мл. Элюат упаривают в вакууме при 40° до небольшого объема, добавляют избыток этанола и выделяют соответствующий пептид. Выход 1,4 г (68,5%); [аШ +80° (2,2% в воде). Для восстановительного отщепления N-тозильной группы вместо натрия может быть использован металлический лптий, барий или кальций [890]. Однако выходы продукта реакции, получаемые при использовании указанных металлов, обычно нпже, чем в случае натрия. Область применения и ограничения. Использование метода восстановления натрием в жидком аммиаке, предложенного Дю Виньо и сотрудниками {11, 690, 842, 862, 867] для отщепления N-карбобензокси-, N-тозильной и S-бензильной групп, а также для расщепления дисульфидной связи, принесло неоценимую пользу при синтезе пептидов, содержащих остаток цистеина или цистина. В каждом из этих случаев реакция протекает с образованием свободной сульфгндрильной группы и поэтому обычно весьма удобно изолировать соответствующий пептид путем его осаждения из реакционной смеси в виде нерастворимой ртутной соли(ср. сработами[11, 473,990]). Разложение водной суспензии ртутной соли сероводородом и последующее удаление осадка сульфида ртути путем фильтрования приводят к получению раствора соответствующего цистепнового пептида, свободного от неорганических солей. Образовавшийся пептид выделяют или непосредственно в виде цистеинового производного, или после окисления к соответствующему цистиновому аналогу (путем аэрации водного раствора при pH от 7,5 до 8,5 до отрицательной реакции на сульфгидрильную группу с нитропруссидом натрия или хлористым железом). В этой связи можно добавить, что если в молекуле исходного пептида содержатся два или более остатков цистеина, то в атом случае имеется возможность внутримолекулярного или межмолекулярного образования дисульфидной связи, причем направление реакции зависит от pH среды и концентрации раствора. Так, например, восстановление 8-бензил-Ь-ци- стеинил-Б-бензил-Ь-цистеина (IX) с помощью натрия в жидком аммиаке приводит к Ь-цистеинил-Ь-цнстеину (X), который после аэрации в 0,15%-ном водном растворе при pH 6,5 путем внутримолекулярного образования дисульфиднон связи легко превращается в циклический монопептид (XI), названный цикло-Ь-цистинилом (методика 166). Однако если pH среды равно 8,5 и концентрация составляет 0,6%, то путем создания межмолекулярных дисульфидных связей между двумя молекулами пептида образуются значительные количества димера, обладающего параллельной структурой (XII), антипараллельной структурой (XIII) или представляющего собой их смесь. Процесс окисления при pH 6,5 напоминает собой процесс внутримолекулярного образования дисульфида в последней стадии синтеза окситоцина, проведенного Дю Виньо и его сотрудниками 182); возможно, что такое окисление при других значениях pH может вести к образованию полимерных веществ. |
