|
ДМИТРИИ ГРИГОРЬЕВИЧ ЗАТУЛА — член-корреспондент АН УССР, доктор биологических наук, заведующий отделом природных противоопухолевых веществ Института проблем онкологии АН УССР. Родился в 1923 г., окончил биологический факультет Харьковского университета, участвовал в Великой Отечественной войне. Д. Г. Затула известен трудами в области микробиологии и онкологии, им предложен метод получения противоопухолевых вакцин, он открыл явление антигенной общности у микроорганизмов и клеток злокачественных опухолей. Д. Г. Затула — автор более 140 научных трудов, член Президиума Всесоюзного микробиологического общества.
СЕВИЛЬ АШРАФ КЫЗЫ МАМЕДОВА — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН УССР. Родилась в 1941 г. в г. Кировабаде, в 1968 г. окончила Азербайджанский государственный универб ситет,ав 1975 г. — аспирантуру при АН УССР и с того времени занимается исследованиями фитопатогенных вирусов. Ею изучены вирусные болезни ряда сельскохозяйственных культур, разработаны методы оздоровления и вакцинации растений. С. А. Мамедова — автор 6 изобретений и 20 научных работ, участник ВДНХ СССР, лауреат Всесоюзного смотра научно-технического творчества молодых.
Введение 3
На подступах к невидимому царству 4
Странные повадки «фильтрующегося яда» 18
Архитектура вируса 41
Вирус в клетке 54
Агрессор в растительном царстве 70
Человек, животные и вирусы 88
Тайны болезни века 111
Заключение
Введение
С древнейших времен человек начал осваивать окружающую его природу и обнаружил существование двух миров: животного и растительного. Люди жили среди представителей этого мира, знакомились с ними, покоряли их. Но по мере того как увеличивалась власть человека над природой, все ярче проявлялось действие каких-то непонятных сил. Их не воспринимали органы чувств, их как будто вообще не было в природе, но действие их нельзя было не заметить — от страшных эпидемий зачастую погибало во много раз больше людей, чем от войн, землетрясений или извержений вулканов.
Некоторые выдающиеся мыслители догадывались, что многие болезни человека, животных и растений — это результат жизнедеятельности микроорганизмов. Ученые древнего мира и средневековья пытались познать врага, искали средства борьбы и защиты. Наблюдения их ценны подробными описаниями симптомов болезней. А после изобретения микроскопа появилась возможность визуально познакомиться с некоторыми обитателями микромира. Благодаря экспериментам ученые сумели узнать характер мельчайших существ и найти средства борьбы со многими из них. Но когда уже казалось, что до окончательного покорения микромира остался один шаг, выяснилось, что не все болезни вызваны известными микроорганизмами.
С помощью остроумного эксперимента русский биолог Д. И. Ивановский доказал существование мельчайших живых частиц — живого «яда», положив начало новой науке — вирусологии.
В большинстве случаев специалисты говорят о вирусах как о врагах человека и всей живой природы.
Однако результаты некоторых исследований позволяют надеяться, что уже в недалеком будущем вирусы станут приносить заметную пользу человеку.
Большие возможности откроются перед человеком, когда удастся «приручить» вирусы и научиться управлять ими. Тогда, например, «выполняя» волю ученого-селекционера, вирус «возьмет» нужные гены (элементарные единицы наследственности) в одной клетке, перенесет их в клетку другого организма и изменит генетический код в нужную сторону, привьет новые полезные свойства различным животным и растениям.
Вирусология опирается на успехи многих других наук. Наиболее важные исследования выполняются с помощью аппаратов и приборов, разработанных физиками, спроектированных конструкторами и инженерами, изготовленных рабочими многих специальностей.
Вирусология — это молодая, развивающаяся наука. Объекты ее исследования малы, и, чтобы обнаружить их, необходимо применять сложнейшие приборы и проводить остроумнейшие опыты. Результаты исследования вирусологов должны будут в значительной степени повлиять на судьбу человечества.
Вирусы пока почти неуправляемы человеком. Однако определенные успехи уже достигнуты. Первые победы обнадеживают, порождают новые идеи.
На подступах к невидимому царству
Две тысячи лет тому назад. Вот уже две недели неудержимо, не встречая никакого сопротивления, вел по чужой земле римскую армию консул Гней Помпей, по прозвищу Великий.
— Разве найдется в этом мире сила, способная остановить мою армию? — обратился Великий Помпей к седому легату, командовавшему первым легионом, куда входили десять лучших когорт римской армии.
Занятый собственными мыслями, легат даже не услышал вопроса. Но консул не обиделся. Он давно уже заметил, что «вернуть» задумавшегося легата в реальный мир очень трудно, и поэтому ответил себе сам:
— Никто и ничто не сможет остановить этих воинов. Они одинаково легко преодолевают горы и болота, сокрушают врагов в открытом бою и штурмуют укрепления.
А легат (выдающийся ученый-энциклопедист), его звали Варрон Марк Теренций Реатинский, размышлял в этот момент о том, что никому не дано знать, во что может обернуться шествие, кажущееся торжественным и могучим. Старый опытный воин думал о том, что сила человека не только в мускулах, но и в уме, а ум тренируется учением, так же как тело — гимнастикой. Он, Марк Варрон, с юных лет учился в Риме и в Афинах, потом написал для соотечественников множество книг, ознакомил их с деяниями 700 знаменитых греков и римлян. Как мало люди еще знают окружающий мир! Но что самое плохое — они даже не хотят его узнать. В природе все организованно, управление производится по самым лучшим законам. Люди станут лучше жить, когда познают законы мира животных и растений, а может быть, и других неведомых им существ. Других? Почему бы и нет? То, что их мы не видим, не означает, что их нет. Возгласы «Виват!» прервали размышления ученого. Это его легион поравнялся с холмом и приветствовал военачальников.
А вечером, когда армия расположилась на привал, обнаружились первые больные. Несмотря на теплую погоду, воины тряслись в ознобе, пытаясь согреться у костров, пылавших всю ночь. К утру заболело столько воинов, что консул понял — его армия потеряла свою боеспособность. Он собрал легатов на военный совет.
Что мог ответить Варрон Реатинский на вопрос консула о причине эпидемии?
— Воля богов? Так чаще всего объясняют опасные загадочные явления, — думал легат. — Но толку от этих объяснений мало, они не помогают бороться с болезнями. Сам Гиппократ, реформатор античной медицины, считал, что с воздухом в организм человека могут попадать ядовитые испарения — миазмы, вызывающие различные болезни. А его соотечественник, величайший историк Фукидид сказал, что причиной болезней являются «живые контагии». Вполне возможно, что они живут по другим законам в своем ином невидимом мире.
И тогда, две тысячи лет назад, древнеримский легат и ученый Варрон высказал смелую гипотезу: «В болотистых местах зарождаются маленькие животные, которых нельзя видеть глазами и которые, распространяясь в воздухе, проникают в тело человека через рот и ноздри, производят серьезные болезни».
Научное предположение о невидимых возбудителях заболеваний, передающихся при посредстве воды ц воздуха, распространилось благодаря выдающемуся врачу и философу Авиценне (в странах Средней Азии и в Иране, где он жил и работал в должности везира, его называли Абу Али Ибн Сина). Почти тысячу лет назад написал он книги о здоровье и болезнях человека, по которым училось много поколений врачей в Европе и странах Востока.
Спустя столетия. Прошли века. Не существуют более рабовладельческие империи. Развеялся над Европой мрачный туман средневековой инквизиции. Войны и восстания периодически сотрясали страны и континенты. Развивалась цивилизация, усилива-
лась хозяйственная деятельность людей. Человек постепенно раскрывал тайны природы, успешно решая проблемы своего существования.
Только одна проблема с незапамятных времен* не поддавалась развившемуся и окрепшему разуму человека. Время от времени страшнее войн и инквизиции обрушивались на поселения, города и страны эпидемии. Чума, оспа, холера, желтая лихорадка, сибирская язва и другие заразные болезни уносили тысячи и тысячи человеческих жизней. Часто эпидемиям сопутствовали эпизоотии, вызывавшие массовую гибель животных. Люди чувствовали себя беспомощными и беззащитными. Даже те, кто никогда не ведал страха перед лицом явной опасности, терялись, когда приходило время бороться с невидимым врагом.
Правда, самые наблюдательные замечали, например, что эпидемии «черной смерти» — чумы предшествовали заболевания мелких грызунов и что болезнь передавалась при контакте с больным, при укусе животным. Самые прозорливые понимали, что истинный возбудитель болезни не заболевший человек или животное, что виновник — невидимка, скрывающийся в заболевшем. Так, в первой половине XVI в. итальянский ученый эпохи Возрождений, врач, астроном, поэт Джироламо Фракасторо возникновение инфекционных заболеваний объяснял действием невидимых мельчайших зародышей, имеющих материальное начало.
Раскрывать тайну опасных невидимок помогали смелые эксперименты ученых, готовых отдать собственные жизни, чтобы приблизиться хотя бы на шаг к победе над эпидемиями. Одним из первых в ряду таких отважных исследователей стоит Эусебио Валли из Лукка (это государство в XIX в. вошло в состав Италии). Валли, сделав на своей руке разрез, внес туда гной из чумного бубона и пустулы черной
оспы, а в результате заразился только чумой, в легкой форме. Было получено ценное научное наблюдение: «при внесении в организм двух различных возбудителей возникает одно, и то сравнительно легкое, заболевание».
Сотни исследователей пытались проникнуть в тайны незримого, но опасного мира. Этот смертельный риск можно понять. Миллионы человеческих жизней слишком высокая плата за незнание законов этого мира и повадок его обитателей. Сейчас подобные эксперименты проводят на лабораторных моделях: разных животных, курином зародыше или тканевых культурах с применением сложных физических и химических приборов, высокочистых реактивов, счетных машин.
«Много микроскоп нам тайности открыл» — так оценил великий русский ученый Михаил Васильевич Ломоносов значение микроскопа в развитии науки о жизни. До XVII в., когда микроскоп еще не сконструировали, мелкие предметы пытались изучать, рассматривая их через отдельные линзы и даже системы увеличительных линз. Невооруженный человеческий глаз может различить две точки, если они отстоят друг от друга не меньше чем на 0,1 мм. Это расстояние и было границей, отделяющей видимый мир от невидимого. Линзы отодвигали границу невидимого, помогая увидеть новые детали, подробности известных объектов. Многие увлекались наблюдениями через увеличительные стекла, но наибольшего успеха добился голландский натуралист Антони ван Левенгук.
Странный мир живых существ, открытый А. Левенгуком, приковывает внимание все новых и новых исследователей, хотя разобраться в нем было не просто. Этот мир умеет хранить свои тайны. Выдающийся шведский натуралист Карл Линней в XVIII в., создавая подробную систематику растительного и животного мира природы, не решился классифицировать микроорганизмы и объединил их в один род под названием «Хаос».
Наблюдения продолжались. В конце XVIII — начале XIX в. были накоплены знания о строении, формах и распространении разнообразных микроорганизмов, признанных самыми маленькими представителями живого мира. Но какова их роль в природе, в жизни человека? Как они живут? Ответы на эти вопросы дала микробиология.
Становление науки о микробах. Основным вопросом, который приковывал умы исследователей микроскопических существ в XVIII в., был вопрос о происхождении микробов, возникновение которых приписывали самозарождению. Однако интересные опыты итальянца Ладзаро Спалланцани и русского Мартына Матвеевича Тереховского указывали на то, что существа, обнаруженные Левенгуком, — это мельчайшие животные, которые в стерильных условиях не зарождаются, а в благоприятной среде развиваются и делятся.
Убедительными были исследования выдающегося французского ученого Луи Пастера. Он так высказался о теории самозарождения: «Нет, сегодня не имеется ни одного известного факта, с помощью которого можно было бы утверждать, что микроскопические существа являлись на свет без зародышей, без родителей, которые их напоминают. Те, кто настаивает на противоположном, являются жертвой заблуждений или плохо проделанных опытов, содержащих ошибки, которые они не сумели заметить или которых не сумели избежать».
Эксперименты с микроорганизмами, проведенные в XIX в. учеными разных стран, были триумфальными. Они позволили всесторонне изучить жизнедеятельность микробов, т. е. их физиологию. Больше того, совсем еще юная наука микробиология начинает участвовать в практической деятельности человека.
Примером правильного отношения ученого к жизненно важным проблемам служит деятельность Луи Пастера, откликнувшегося на сигнал бедствия, поданный виноградарями.
Человек, девиз которого был: «Поиск нового, наука — для жизни и практики», сочувственно отнесся к просьбам виноделов спасти их лучшие вина от порчи. Они рассказали, что иногда, совсем неожиданно и беспричинно, вино превращалось в кислый уксус. Какие только не пробовали они применять средства, чтобы спасти свою продукцию, но все было безрезультатно.
Пастер принялся за работу. Заглядывая чуть ли не в каждую бочку, он заметил кое-где пленки, плавающие на поверхности вина. Он обнаружил одну интересную и важную закономерность: чем плотнее пленка, тем больше кислоты в вине. В кусочке пленки под микроскопом ученый обнаружил микробы своеобразной формы. Чтобы доказать их виновность, Пастер поставил эксперимент. Он взял вино высокого качества и налил его в два сосуда. В один из них положил кусочек пленки из бочки со скисшим вином, второй запечатал, оставив его для контроля. Подозрения оправдались: в первом сосуде вино превратилось в уксус, а в контрольном осталось без изменений. Причина скисания вина — микробы.
Найдя виновников бедствия, Пастер разрабатывает метод борьбы, известный в настоящее время под названием пастеризации. Микробы следует убивать нагреванием. С тех пор фруктовые соки, молоко и другие пищевые продукты прогревают до 65 — 80°С (пастеризуют). При такой температуре питательные свойства продуктов сохраняются, а микробы гибнут. Эти приемы применяют и для стерилизации медицин-
ских инструментов и материалов, но при более высоких температурах — 100°С и более.
Слава Пастера разнеслась по всей Франции. К нему обратились шелководы. Гибель шелковичных червей от какой-то таинственной болезни наносила большой экономический ущерб. И ученый нашел микробы — возбудители болезней тутовых шелкопрядов. Дорога к секретам эпидемий и эпизоотий была открыта.
В своих научных трудах Пастер показал не только вредную роль микроорганизмов, но и полезную. Особое признание человечества Луи Пастер заслужил, пожалуй, за метод предохранительных прививок.
Возбудитель против возбудителя. Стремление человечества победить болезни проявлялось с давних времен. Правда, особых успехов достичь не удавалось. Но уже с XI в. в Персии известна процедура втирания в разрезы кожи порошка из оспенных струпьев. На Кавказе по крайней мере с XVIII в. девочкам делали уколы иголками, смоченными в жидкости из оспенных язв. Родители старались уберечь их от болезней. Они считали (и вполне справедливо), что дочери, переболевшие оспой, будут менее красивыми из-за рябин на лице. Неизвестно, как в разных странах люди «угадали» способы предохранительных прививок, но в 1788 г. английский врач Эдуард Дженнер уже сознательно рискнул провести эксперимент. Будучи образованным и наблюдательным человеком, он заметил, что крестьяне, заражавшиеся когда-либо «коровьей» оспой, оставались не восприимчивыми к «черной заразе», как называли ее в народе. Но одной наблюдательности в науке зачастую недостаточно. Необходима была проверка. Только человек, обладающий огромным мужеством, мог выступить один против двух беспощадных врагов человечества — эпидемии оспы и суеверия. И Дженнер вышел победителем из этого единоборства.
Однако повсеместному распространению метод противооспенной прививки по Дженнеру обязан в первую очередь Луи Пастеру. Заложив теоретические основы иммунологии — науки о защитных реакциях организма, Пастер разработал принцип создания вакцин. Он и его сотрудники сделали вакцины против сибирской язвы, бешенства, куриной холеры, свиной краснухи. Многие века людям становилось страшно только от одних слов: чума, оспа, холера. Получалось так, что человека, властелина и покровителя животного и растительного мира, в любой момент могут победить пришельцы — невидимые существа, маленькие, но многочисленные. Но человек все же не напрасно наделен разумом. Проникнув в некоторые тайны открытого недавнего царства, ученые поняли, что в бой против опасного противника необходимо посылать его «соплеменников», но «прирученных», как бы укрощенных и потому не опасных для человека. В полном соответствии с пословицей «клин клином вышибают» Пастер и его последователи начали вводить ослабленных микробов людям и животным, предупреждая поражение их такими же, но заразными, полными энергии микробами. Удивительно просто! Очень просто, но вместе с тем мудро. Первым и, пожалуй, самым главным этапом вакцинации является обнаружение возбудителя.
Охота на микробов. Левенгук рассматривал микробы на просвет. Впоследствии его метод назовут методом висячей капли. Назовут так потому, что капля располагается между источником света и объективом. Исследователь на фоне прозрачной жидкости видит контуры микроскопических объектов и их движение (если они способны двигаться). Но детали разобрать не удается. А это очень важно. Нужно точно определить название микроба, ошибиться нельзя — от качества работы зависит здоровье, а зачастую и жизнь людей.
Чтобы изучить какой-либо материальный объект, желательно его иметь. Очень простая, или, как говорили сто лет тому назад, банальная, истина. Таким образом, чтобы изучить возбудителя какой-либо инфекционной болезни, нужно отделить его от примесей, других микроскопических объектов, которые находятся в микробной взвеси, т. е. получить чистую культуру бактерий. На разные хитрости шли исследователи, чтобы освободиться от примесей, получить эту чистую культуру. Переворот в методике микробиологических исследований суждено было сделать выдающемуся немецкому микробиологу Ро берту Коху, который впервые использовал желатин как твердую среду для микробов.
Частицы почвы, капельки воды или выделений наносятся на питательную среду (засеваются). Отдельные клетки, попав в благоприятные условия, начинают размножаться, и через некоторое время на поверхности среды образуются колонии с тысячами микробов, свободных от загрязнений.
В бактериологическую практику Р. Кох ввел также метод окраски микробов анилиновыми красителями. Нужда в такой окраске была большая. Р. Кох обнаружил, что в зависимости от химического состава и физико-химических свойств микробы окрашиваются в различные цвета. В дальнейшем другими учеными были предложены различные методы окраски. Так, одна группа микроорганизмов принимает всегда только красный цвет, другая — только сине-фиолетовый и т. д.
Следующий этап — различие по характеру движения. Например, брюшнотифозные и дизентерийные бактерии окрашиваются в одинаковый красный цвет и даже имеют одинаковую форму и размеры. Значит, необходимо определить их подвижность, рассмотрев на просвет в капле. Брюшнотифозные бактерии подвижны, дизентерийные — нет.
Применяя сложные методы окраски, можно в микробах из класса простейших обнаружить ядро и цитоплазму. Так, если ядро окрасилось в красный цвет, а цитоплазма — в синий, значит, под микроскопом находится возбудитель малярии.
С помощью этих и некоторых других методов во второй половине XIX в. и первой четверти XX в. были открыты болезнетворные микробы нескольких десятков инфекционных болезней: бациллы и стрептококки, бактерии и спирохеты, рикетсии и плаз модии, амебы и... кокки. Раскрытие тайн царстса микробов стоило человечеству немалых усилий. Были достигнуты существенные успехи. И тем не менее лозунг «Без микробов нет инфекционных болезней» не удалось полностью утвердить. Не удалось потому, что, наряду со многими победами, были и серьезные поражения. Как ни пытались ученые выделить микробов — возбудителей оспы, бешенства, гриппа, ящура крупного рогатого скота и свиней, это им не удавалось. Не помогали ни старые испытанные приемы, ни новейшие методы исследований. Не давали результатов остроумные эксперименты. Загадки порождали различные гипотезы о природе болезней. Естественно, что, не зная возбудителей, трудно было бороться с болезнями и нельзя было рассчитывать на успех. Это был тупик, вывести из которого могло только новое открытие, обнаружение чего-то такого, о чем не знали, не догадывались ученые.
И открытие состоялось! Самым неожиданным оказалось то, что возбудителями этих инфекционных заболеваний оказались не микробы! Возбудители оказались совсем из другого мира природы. Их изучает наука вирусология. Об этом и пойдет дальше наш рассказ. Но прежде чем вплотную заняться вирусами, нам хотелось бы дополнить эту главу, посвященную в основном отрицательной, болезнетворной роли микробов, очень краткими сведениями о той положительной роли, которую они играют в природе, и о пользе, которую они приносят людям.
Похвальное слово микробам. Тысячелетиями использовал человек микроорганизмы для приготовления пищевых продуктов (кумыс, кефир, простокваша, сыр, хлеб, а также вина, пиво, уксус и др.); при вымачивании льна (в производстве льняных тканей); при силосовании (с их помощью сохраняются и увеличиваются питательные качества зеленого корма).
По мере развития науки о микробах ученые постепенно раскрывали причину многих процессов. Благодаря полученным знаниям появилась возможность регулировать эти'процессы, улучшать промышленный выпуск продуктов питания человека и кормов, в которых нуждается животноводство. Кроме того, человек заставил микробы вырабатывать бактериальные удобрения, антибиотики, витамины, препараты для защиты растений и др.
Страшно даже представить, что может случиться, если вдруг микробы перестанут участвовать в круговороте веществ в почве или хотя бы ослабят свою активную деятельность. Через очень короткое в масштабах истории время вся наша планета окажется заваленной остатками представителей живого и растительного мира. В природе не будут образовываться питательные для растений вещества. Исчезнет зеленый корм — погибнут животные.
Почвенной микрофлорой занимается сельскохозяйственная микробиология. В круг ее интересов входит также изучение микробов, вызывающих заболевания растений, и борьба с ними, разработка
микробиологических способов борьбы с насекомыми — вредителями растений, методов консервирования кормов и предохранения урожая от порчи. Изучают микробы геологи, металлурги, потому что некоторые бактерии способны выделять металлы из руд (медь, германий, уран, олово), а другие, наоборот, превращать сталь в отходы. Что касается болезнетворных микроорганизмов, то и они чуть-чуть полезны, потому что из них делают вакцины для предохранения от заболеваний. От тех самых, которые они сами вызывают.
Странные повадки «фильтрующегося яда»
Открытие Д. И. Ивановского Велики были достижения микробиологической науки в последней четверти XIX в. Победа ученых над многими болезнями вселяла надежду на полное избавление уже в ближайшем будущем от эпидемий, эпизоотий и эпифитотий (так называют массовые инфекционные заболевания растений).
Эпизоотии чумы крупного рогатого скота вызывали гибель миллионов коров, оставляя население Европы без важных продуктов питания. Постигнуть тайну этой болезни пытались многие ученые. В 1886 г. тогда еще молодой врач, будущий выдающийся русский ученый Н. Ф. Гамалея решил взять у больного чумой теленка кровь, пропустил ее через специальный фильтр, который задерживал самых мелких бактерий, и ввел эту кровь здоровому теленку.
Большинство ученых считали, что без микробов нет инфекционных болезней. Им даже не пришла в голову мысль выполнить подобный эксперимент. С какой стати заразится теленок, если фильтр такой мелкий, что задерживает любых микробов! Да и в
микроскопы (увеличивали они тогда до 2000 раз) ничего не видно. Но случилось непредвиденное. Через несколько дней подопытный теленок заболел типичной формой чумы. Следует отметить, что зачастую именно вот такие, не вписывающиеся в рамки научных представлений, случаи давали толчок новому направлению науки. Правда, Н. Ф. Гамалея не раскрыл до конца природу возбудителя, но его опыт привлек внимание других исследователей.
Спустя 6 лет, в 1892 г., другой русский ученый — Д. И. Ивановский все же определил типичные приметы» невидимого возбудителя, названного позже вирусом. Повадки вируса, найденного Д. И. Ивановским, выдавали в нем представителя совсем другого мира. Первый обнаруженный человеком вирус получил странное на первый взгляд название «вирус табачной мозаики» (ВТМ).
В 1887 г. студента Петербургского университета Д. И. Ивановского командировали в Крым и Молдавию изучать болезни табака, на сочных, зеленых листьях которого появлялись пятна и кольца. Сначала маленькие светло-зеленые, едва заметные, они быстро расползались, становились желтыми, бурыми. Листья скручивались и вяли. Бедствие это постигало целые плантации. Ни благоприятные погодные условия, ни хороший уход не могли спасти растения. Это можно было сравнить с чумой, с холерой, с другими повальными эпидемиями. Поэтому Д. И. Ивановский и даже более опытные его учителя считали, что доказать микробную природу поражения табака будет нетрудно. Стоит только приготовить препараты, окрасить их и посмотреть в микроскоп. Именно так уже были найдены возбудители многих заболеваний.
Молодой ученый с огромным упорством перепробовал всевозможные способы выявления микробов в соке пораженных растений, часами сидел прильнув к окуляру микроскопа, но возбудителя не удавалось увидеть. «А может быть, его никогда и не было? — часто задавал себе этот вопрос ученый. — Но тогда почему же заражаются здоровые растения, если шприцем ввести в них сок больного растения?» Молодой исследователь пытался вырастить возбудителей на искусственной питательной среде. Уже многим удалось культивировать микробы и выращивать их в любых количествах. Но и эта серия экспериментов не дала никаких результатов. Точнее, результаты были отрицательными — микробы не росли. Правда, в науке часто отрицательные результаты представляют не меньшую ценность, чем положительные. Необходимо только правильно оценить их. Д. И. Ивановского неудача не обескуражила. Он проводит новый эксперимент: сок больных листьев ученый пропускает через фильтр, отверстия которого были меньше любого микроба, а затем этот «чистый» прозрачный сок вводит здоровым растениям. Прошло несколько дней, и вдруг на листьях
стали возникать характерные симптомы все той же мозаики. Значит, микробы ни при чем! Значит, в отфильтрованном соке был яд — химическое соединение, от которого и заболели растения! Теперь ясно, почему он не «размножается» на питательной среде.
Несмотря на «очевидную» химическую природу возбудителя болезни, Д. И. Ивановский проводит новую серию экспериментов. Он решает перезаражать растения. Выделив сок из зараженного растения, ученый вводит его здоровому. Оно заболевает, и тогда уже его соком он заражает новое растение. Естественно, в процессе таких перезаражений (пассажей) концентрация яда уменьшается и рано или поздно его действие прекращается. Д. И. Ивановский неутомимо проводит пассаж за пассажем, но уродливые пятна на поверхности листьев не исчезают. Ученый делает % вывод — возбудитель заболевания табака живой, он размножается только в живом растении, но настолько мал, что проходит через бактериальные фильтры. Итак, благодаря надежным и тщательно проведенным экспериментам Д. И. Ивановского был открыт болезнетворный микроб совершенно нового вида с неизвестными ранее свойствами. Фильтрующийся вирус (такое название получил вновь обнаруженный возбудитель) обратил на себя внимание многих исследователей, хотя и не всеми был признан сразу.
Вездесущие агенты невидимого царства. В 1897 г., через 5 лет после открытия Д. И. Ивановского, немецкие ученые Ф. Леффлер и П. Фрош доказали, что болезнь крупного рогатого скота ящур тоже вызывается вирусом. Вскоре после этих открытий были описаны вирусы оспы овец, чумы птиц, бешенства, чумы собак и т. д. А в 1917 г. Ф. Д’Эррель открыл еще бактериофаги, т. е. вирусы бактерий, которых называли «пожирающие бактерии». Постепенно ученые пришли к выводу, что представители недавно открытого царства природы способны паразитировать в клетках различных живых организмов. За первые несколько десятилетий успехи вирусологов можно характеризовать как «количественное накопление» вирусов. Результаты изучения их свойств были очень скромными. Ученые пытались проникнуть в тайну вирусов, познакомиться с ними. Для этого привлекались самые новые аппараты, разрабатывались остроумные эксперименты. Но что поделаешь, если исследуемый не виден, если для его размножения нужны живые клеточные организмы и если с каждым новым наблюдением возникают все более сложные вопросы. Чего, например, стоила такая загадка, обнаруженная еще самим Д. И. Ивановским: вирус — живое размножающееся существо может образовывать настоящие кристаллы, как обычное неорганическое вещество. Зачем нужно эо? Как ему удается жить, будучи кристаллом? Или, например, странная избирательность и строгая специализация: одни вирусы заразительны только для животных и человека, другие — только для растений; вирус оспы вызывает только оспу, а не грипп. Подобных вопросов было много, а ответов — мало.
Что или кто? Начатую К. Линнеем систематизацию живой природы продолжали другие ученые. Сейчас уже сложилось достаточно четкое представление об эволюции, о происхождении и родственных связях, степенях подобия и различия живых существ. Всех существ, кроме вирусов. Все живое на Земле было разделено на два мира: мир растений и мир животных.
Оказалось, что найти место для вирусов в живой природе не так-то просто. Кстати, даже название его — virus — в переводе на русский язык означает «яд». Даже этот термин не свидетельствует о принадлежности его к живым существам. Но дело не в названии.
Отличить живое от неживого может почти каждый. Живое дышит, питается, растет, размножается и т. п. Классическое научное определение жизни дал Ф. Энгельс: «Жизнь есть способ существования белковых тел, существенным моментом которого есть постоянный обмен веществ с окружающей их внешней природой». В последнее время основным элементом живого кроме белков обязательно считается наличие нуклеиновой кислоты, имеющей первостепенное значение для сохранения и передачи генетической информации от родителей к потомкам.
На первый взгляд вирусы относятся к живым существам. Они состоят из белков и нуклеиновых кислот, создают себе подобных, изменяются. Однако до сих пор не доказано наличие основного признака живого — собственного обмена веществ. Да и размножаются вирусы необычным способом (как именно, вы узнаете позже). А способность образовывать кристаллы и сохраняться в виде такого типичного вещества неживой природы вообще не дает права отнести вирусы к живой природе. Крупнейший советский вирусолог В. М. Жданов выделил вирусы из мира растений и животных в отдельный, третий мир живой природы — мир вирусов.
Подобно древнеримскому богу Янусу, изображавшемуся с двумя лицами, обращенными в разные стороны, вирусы тоже удивительно сочетают в себе двойственность свойств живой и неживой природы. Но все же большинство свойств вирусных частиц характерны для живой природы.
Как увидеть самое маленькое? О существовании материальных природных объектов человек узнал главным образом благодаря зрению, а также другим органам чувств. Помните, микробы тоже впервые были обнаружены при наблюдении под микроскопом. Оптические микроскопы продолжали совершенствоваться. С каждым новым достижением оп-тиков-приборостроителей у вирусологов появлялась надежда увидеть предмет их исследований. Но даже при предельном для оптического микроскопа увеличении в 1500 раз увидеть врага «в лицо» не удавалось. Почти 50 лет продолжалось несколько парадоксальное для науки явление. Вирусы изучали, были известны их свойства и результаты коварной деятельности, но получить достоверное понятие о форме и «конструкции» не могли.
К числу выдающихся успехов науки и техники следует отнести создание электронного микроскопа — удивительного аппарата, увеличивающего изображение исследуемых объектов в миллион раз. В микроскопе вместо световых лучей используются пучки электронов. Электроны испускаются катодом и ускоряются в электрическом поле с разностью потенциалов клетки — катодом и анодом в несколько десятков тысяч вольт. Поток электронов с колоссальной скоростью несется внутри микроскопной камеры, из которой откачан воздух. Вонзаясь в объект исследования (частицу металла, клетку растения или интересующий нас вирус), электроны рассеиваются и отклоняются от первоначальной траектории движения. А двигаются они к объективной линзе, где и формируется видимое изображение. Это изображение дополнительно увеличивают с помощью линз светового микроскопа (он тоже встроен в электронный микроскоп). В конце концов лучи попадают на экран и фиксируются на фотопленке.
Что же можно увидеть на экране? Электроны по-разному рассеиваются от различных участков исследуемого объекта. Чтобы различить отдельные участки объекта и сам объект от фона, необходимо получить контрастное изображение. Чем больше различаются по атомному номеру соседние участки, тем больший между ними будет контраст, тем легче их будет исследовать. Есть еще одно условие получения хорошего изображения — толщина просвечиваемого слоя не должна быть меньше определенной критической толщины. Чем больше атомные номера элементов, из которых состоят исследуемые обь-екты, тем меньше может быть толщина объекта. Биологические объекты, в том числе и вирусы, состоят из веществ с малым атомным номером: водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора и др. Это значит, что в самый мощный микроскоп едва удается рассмотреть объект толщиной меньше 500А (или 50 ммк). А — это ангстрем — единица длины,
равная десятимиллиардной доли метра. 1 А = 10 10 м = 1(Г8см.
Первый взгляд на вирусы. Чтобы различить вирусы (иногда размером менее 10 ммк), вирусологам пришлось много поработать. Аппаратура сама по себе не спасла положение. Помогли методы контрастирования: оттенение тяжелыми металлами, избирательное окрашивание солями тяжелых металлов и др.
Уже из названия методов ясно, что речь идет о взаимодействии исследуемых биологических объектов с атомами и молекулами тяжелых металлов, а также углерода. Так, при оттенении вирусов на препарат напыляют тончайший слой платины, золота, вольфрама, хрома. Метод позитивного контрастирования основан на том, что соли тяжелых металлов по-разному, выборочно реагируют с различными биологическими веществами. Соли свинца соединяются с белковыми компонентами клеток и тканей, осмий — с липидными веществами и т. п. В результате такой «окраски» структуры приобретают особую контрастность.
В основе метода негативного контрастирования лежит другой принцип. Для контрастирования выбирают также вещества с солями тяжелых металлов, но не реагирующие с исследуемым биологическим объектом. Контрастирующее вещество высокой плотности наносят на подложку вместе с вирусом. Теперь вирус в микроскоп виден на темном плотном фоне.
Приготовленные тем или иным методом вирусные препараты в конце концов попадают в электронный микроскоп. И здесь мы можем определить их размеры. Сделать это теперь сравнительно легко, необходимо только правильно выбрать масштаб увеличения.
Разведение и титрование вирусного препарата на растениях.
Мы не будем измерять вирусные частицы, а воспользуемся сравнением их с известными предметами, приведенными в книге известного американского вирусолога и биохимика У. М. Стэнли: «Хотя вирусная частица — настоящий гигант среди химических молекул, все же, чтобы заполнить такими частицами мячик для пинг-понга, потребовалось бы 1000000000000000000 частиц вируса полиомиелита».
Клетка человеческого организма, куда внедряется
и которую разрушает вирус, является как бы домом для незваного гостя. Причем домом не маленьким. Например, вирус полиомиелита так же мал по сравнению с клеткой, как человек по отношению к 30-этажному зданию.
Титрование. В практике вирусологии большое значение имеет активность вирусов. Для того чтобы исследовать, например, активность вируса табачной мозаики, из листьев пораженного растения отжимают сок. В этом соке (его называют нативным) вместе с частицами разрушенных клеток плавают и вирусы.
Если ввести такой сок (или экстракт из ткани пораженного организма) в организм мышей, в куриный эмбрион или в клетки определенного растения-индикатора, то через некоторое время появляются следы поражения.
При титровании сок (или экстракт) последовательно разводят дистиллированной водой или буферными растворами, с каждым действием уменьшая концентрацию нативного сока (а следовательно, и концентрацию вирусов) в десять, сто, тысячу раз. Этими «разведениями» заражают отдельный индикатор (растение, эмбрион и т. п.). На клетки индикаторов набрасываются тысячи или единицы вирусов (это зависит от «разведений») и приступают к своей разрушительной работе. И хотя вирусы не были видны, но результаты их работы вскоре становятся очевидными.
Чем больше активность вирусов, чем выше концентрация, тем скорее и больше появится пораженных клеток. Количество очагов (бляшек) можно сосчитать, площадь и время их появления можно замерить, значит, можно рассчитать скорость, плотность и т. д. Появляется возможность количественной обработки результатов исследования, без которой не могут обходиться естествоиспытатели.
Проблема очистки. Если при титровании в препаратах и допускаются обломки клеток, то проводить другие исследования они мешают. К примеру, клеточные компоненты, по форме и размерам сходные с исследуемыми вирусами, трудно будет отличить при электронно-микроскопических исследованиях.
Решить задачу очистки вирусных препаратов намного труднее, чем найти иголку в стоге сена. Иголку хоть можно увидеть да и физические свойства ее значительно отличаются от сушеной травы (благодаря чему, например, стальную иголку можно вытащить из стога магнитом). Вирус — невидимка, а многие физические свойства его точно такие же, как и других биологических частичек, вместе с которыми он плавает в растворе.
Для решения такой задачи нужны хорошие знания физики и химии, обстоятельное знакомство с современными методами исследований и смекалка.
Наиболее распространенный метод выделения вирусов основан на разности масс и размеров различных компонентов растворов, где находятся вирусы, и называется он методом дифференциального центрифугирования. Вирусы, устойчивые к действию спирта, можно сконцентрировать с помощью спиртов.
Известно, что вирус гриппа обладает способностью агглютинировать (склеивать) эритроциты. И эта его способность используется для предварительной очистки. В основе метода гель-фильтрации заложено различие в размерах компонентов, а в основе хромотографии — различие в химических свойствах.
Впервые очищенный препарат вируса был получен в 1935 г. У. М. Стэнли очистил и выделил в кристаллическом виде вирус мозаики табака. Первый метод был заимствован из химии белков и основан на том, что растворимость различных белковых тел
при изменении степени кислотности растворов происходит по-разному. Начинают выделение с того, что листья растений табака замораживают в течение нескольких часов, после чего их измельчают. Измельченный материал разводят буфер-раствором фосфорной кислоты и ее солей. После тщательного взбалтывания смесь фильтруют сначала через марлю, а затем через инфузорную землю. В фильтрат добавляют раствор сернокислого аммония, под действием которого и происходит осаждение вируса. При следующей фильтрации вирус адсорбируется на особом поглотителе — инфузорной земле, которую снова промывают фосфатным буфером. Вирус переходит в раствор. Переосажение и перерастворе-ние вируса производят несколько раз, повышая тем самым его концентрацию. Последней операцией является добавление в фильтрат насыщенного раствора сернокислого аммония и ледяной уксусной кислоты. Вирусы выпадают в виде микроскопических игловидных паракристаллов (жидких кристаллов). К сожалению, чуть ли не к каждому возбудителю болезней требуется особый подход, и бывает, что поиск индивидуальных путей очистки длится долгие годы. Так, например, вирус полиомиелита самому У. М. Стэнли удалось выделить только в 1955 г.
Несколько других методов очистки основаны на свойстве коллоидных систем разрушаться в определенных условиях, например когда в растворе, стабилизированном электролитом, число отрицательных частиц равно числу положительных (в так называемых изоэлектрических точках).
Некоторые вирусы, патогенные для животных и человека, выделяются путем адсорбции их коллоидными осадками гидрата аммония или сернокислого кальция. Этим способом можно очистить вирусы ящура и полиомиелита.
Гравитация служит вирусологам. Одной из самых заманчивых для человечества тайн природы является гравитационное поле. Познание и освоение гравитационных полей обещает получение нового источника энергии, бесшумных гравитолетов без крыльев, и осуществление многих других фантастических проектов. Однако уже сейчас загадочные силы тяжести служат вирусологам.
Всем известна заслуга центрифуги — аппарата для создания дополнительной силы тяжести — в деле подготовки космонавтов, но мало кто знает, что подобные аппараты применяют и в биологии.
Ротор современной ультрацентрифуги вращается со скоростью до 35 тыс. оборотов в минуту. В ячейках ротора размещают пробирки с препаратами. Одновременно здесь может быть создан почти космический вакуум, в котором автоматически поддерживается заданная температура. Однокопеечная монета в нормальных земных условиях весит 1 г. В центрифуге ее вес превысил бы 100 кг, а вес вируса достигнет одной десятитысячной микрограмма. Одновременно увеличивается и вес обломков клеток и других частичек. Благодаря этому происходит разделение веществ. Более тяжелые вещества (частицы) осаждаются на дно, легкие остаются в верхней части пробирки. После такого разделения легко определить плотности веществ в каждом слое, в том числе и в вирусном.
Масса вирусной частицы, а в случае сферических вирусов также и ее размер могут быть установлены методом седиментации, сущность которого состоит в том, что скорость осаждения вирусных частиц при ультрацентрифугировании находится в определенной зависимости от их размера, плотности и вязкости среды и центробежной силы.
Величина вирусных частиц колеблется в широких пределах. Размер частиц вируса ящура составляет всего 210 А, а вируса пситтакоза — 4550 А. Первая величина близка к размерам белковых частиц, например гемоглобина, вторая — превосходит размеры (1500 А) возбудителя плевропневмонии крупного рогатого скота, способного расти на искусственных питательных средах.
Организм отбивает вторжение антигенов. Часто бывает, что практические рекомендации опытным (эмпирическим) путем ученые успевают разработать раньше, чем удовлетворительно объяснить результаты опытов. Так было и с иммунизацией.
Иммунизация основана на замечательном свойстве живого организма вырабатывать антитела. Эти особые вещества появляются в организме специально, только тогда, когда в него проникает чужеродное тело, опасное для организма (бактерии, вирусы или токсины).
Чужеродные вещества, именно те, против которых вырабатываются антитела, называют антигена-м и. Иногда (такие случаи известны и в вирусологии) организм по какой-либо причине не реагирует на появление чужеродного вещества и антител не вырабатывает. Тогда бактерии или вирусы начинают беспрепятственно действовать в организме. К счастью, это случается редко.
Намного чаще проникающие в организм незваные пришельцы (антигены) замечаются им и встречаются во всеоружии. Точнее, против каждого вида антигена вырабатывается и свой особый вид оружия — специфичное антитело. Организм, содержащий антитела против какой-либо чужеродной информации (патогенного возбудителя), называют иммунным. Например, в результате вакцинации человека против оспы он становится невосприимчивым, т. е. иммунным, и будет готов противостоять вторжению вирулентных вирусов оспы.
Как образуются антитела, как они действуют против чужеродных антигенов и многие другие проблемы, связанные с защитными реакциями организма, изучает специальная наука широкого профиля — иммунология. Мы не будем вдаваться в подробности этой большой важной комплексной дисциплины, но поскольку иммунология рассматривает вирусы тоже как антигены, то познакомимся с некоторыми событиями, происходящими в организме после того, как вирус-антиген попадает в него.
Преодолев кожные, эпителиальные и другие барьеры организма, вирус или любой другой возбудитель (антиген) заболевания проникает в кровь и лимфу. С этого момента начинает работать механизм образования антител за счет действия цитоплазматических клеток. В крови синтезируются иммун-ноглобулины — антитела разных классов. С этого времени в крови носителей вирусов кроме красных кровяных клеток (эритроцитов), белых кровяных клеток (лейкоцитов) и многих других элементов клеток присутствуют также антигены и специфические к ним антитела. Все это находится в жидкой части крови — сыворотке. Сыворотка, лишенная форменных элементов и содержащая иммунногло-булины — антитела, называется антисывороткой.
Чужеродные антигены в антисыворотке долго не задерживаются в свободном виде. Они связываются антителами, образуя конгломераты, и эти крупные объединения в виде хлопьев осаждаются. Этот процесс осаждения называют преципитацией (если осаждается свободный антиген), или агглютинацией (если осаждается антиген, связанный с клеткой), или гемагглютинацией (если антиген связан с эритроцитами).
В агаровой пластине средняя лунка была наполнена антисывороткой, верхняя и нижняя лунки — растворами с вирусами (ромбы и круги). В течение нескольких часов вещества диффундировали во все стороны.
Вирусы в нижней лунке оказались антигенами, соответствующими антителам в антисыворотке, поэтому между средней и нижней лунками произошла реакция преципитации.
Как бы ни назывались эти типы серологических реакций, для организма они важны тем, что опасные антигены теряют подвижность, оседают в крови, захватываются фагоцитирующими клетками, поглощаются и перевариваются ими. Так организм борется с опознанными агрессорами.
Серологические реакции служат идентификации.
Реакции преципитации (или агглютинации, или ге-магглютинации) могут протекать не только в крови, но и в сыворотке. Если антисыворотку, т. е. сыворотку крови, в которой есть антитела, налить в пробирку и добавить в нее раствор с антигенами, то возможно следующее: прозрачный раствор помутнеет, в пробирке появятся хлопья и начнут оседать на дно; никаких заметных изменений не произойдет. Очевидно, в первом случае в антисыворотке были антитела, точно соответствующие добавленным антигенам.
Антитела бросились ца врагов и, лиишв их активности, осадили. Во втором случае антигены оказались неопознанными и «стражи» не проявили к ним никакого интереса.
Конечно, такое явление природы, как иммунизация, ученые использовали для целей диагностики. Серологические реакции надежно показывают, соответствует ли антитело антигену. В простейшем случае делается это так: берут каплю сыворотки крови животных (сок растений), подозреваемых на вирусоносительство, и соединяют с каплей антисыворотки с антителом, «порожденным» известным вирусом. По очереди проверяя антисыворотки с различными антителами, следят, не произойдет ли реакция преципитации. Все это делают на чистом предметном стекле, где хорошо заметно выпадение осадка. Конечно, в наборе антисывороток может не оказаться такой, в которой содержится антитело, подходящее к исследуемому вирусу, и тогда ни в одной из капель осадок не выпадает.
Обычно исследования проводят в среде агара. Прозрачные стеклянные блюдечки — чашки Петри — наполняют раствором желатина (агара). Еще до затвердевания в агаре с помощью формочек делают лунки. В эти лунки заливают антигены (растворы с вирусами) и антисыворотки. Вещества начинают медленно распространяться во все стороны и встречаются между лунками. Реакция преципитации оставляет характерный след — белую полосу образовавшегося в агаре осадка.
В биологии большое применение нашли меченые атомы. Радиоактивными изотопами заменяют обычные атомы некоторых элементов, входящих в клетку, сыворотку и т. п. Радиоактивный атом непрерывно сигнализирует о своем местонахождении. Ничтожное, не опасное в целом для организма, радиоактивное излучение легко уловить приборами, даже когда
элемент «забрался» в глубь клетки. Этим свойством и пользуются вирусологи. В антитело, не повреждая его, внедряют радиоактивные атомы. Оказавшись в крови (соке) или клетках организма, антитела разыщут соответствующие антигены — вирусы и свяжутся с ними. Теперь уже изотоп будет сигнализировать и о месте нахождения антигена. Если к антителам присоединить флюоресцирующую краску, то тогда соответствующий антиген станет замечен по свечению.
Прочная опора — фундаментальные науки. Тысячелетиями подвергались люди, животные, растения агрессивному нападению со стороны вирусов. Враг был невидим, повадки его непонятны. Только получив в свое распоряжение надежную аппаратуру и реактивы, разработав остроумные методы исследования, ученые смогли приступить к планомерному изучению вирусов. Оружие вирусологов разнообразно по своему характеру и целям. Так, например, очистку вирусных препаратов и выделение белковых и нуклеиновых компонентов производят не только ультрацентрифугированием, но и адсорбцией на ионных обменниках, фильтрацией через молекулярные сита.
Выращивали (культивировали) вирусы до 50-х гг. только одним методом — заражением восприимчивых животных, куриных эмбрионов или растений. Сейчас в арсенале исследователей — методы однослойных культур тканей и даже органов, значительно облегчившие очистку вирусов, изучение их физических, химических и биологических свойств.
Кроме физических и химических методов на вооружении вирусологов находятся и математические приемы. Вклад математики в развитие фундаментальных и прикладных наук общеизвестен. Не обойтись без расчетов и в вирусологии. Особая
нужда в них вызвана тем, что объект исследования чрезвычайно мал и изучению нередко подвергается не один отдельный вирус — вирион, а их масса — популяция. Свойства популяции не всегда совпадают со свойствами одного вируса. Для исследования и описания «суммарных» свойств служат статистические методы. Кроме того, математика помогает на стадии планирования эксперимента. Очень желательно заранее предугадывать результат хотя бы по известным аналогичным исследованиям или грубым предварительным опытам. Оценивать такие результаты положено с так называемых оптимистической и пессимистической точек зрения. Благодаря точной науке биологи могут учесть случайность выбора подопытного кролика, количество инъекций, время проведения экспериментов и воспроизводимость результатов.
Проводить математический анализ помогают вычислительные машины. Электронным вычислительным машинам поручают и важнейшую работу по диагностике вирусных заболеваний. Машины стали надежными помощниками врача в оценке огромного потока информации о состоянии больного.
Работа вирусолога сложна, многогранна и ответственна. Самое современное исследовательское «оружие» эффективно только в умелых руках. Ученым приходится иметь дело и с мельчайшими частицами, и с подопытными животными, и с большими плантациями растений. Работа не безопасная, с вирусами шутки плохи — это коварный и опасный объект исследования, с ним следует работать со всеми предосторожностями.
«Архитектура» вируса
Нерукотворные сооружения. История человечест-ва насчитывает тысячелетия. И самыми характерными, самыми основательными следами древних цивилизаций, пожалуй, являются остатки культовых сооружений, дворцов, общественных зданий... Ежегодно миллионы людей любуются выдающимися произведениями безвестных и известных зодчих, сумевших воплотить в материале основные требования строительной науки: пользу, прочность и красоту.
Когда рассматриваешь в электронном микроскопе различные вирионы, поневоле приходит на ум сравнение их с фантастическими, а иногда и совсем реальными сооружениями — памятниками высокоразвитых цивилизаций. И тем более удивительно, что эти совершенные формы созданы самой природой, без вмешательства человека.
Итак, вирусологи изыскивают всевозможные методы, пытаясь получше разглядеть обитателей изучаемого препарата вирусов, увидеть их форму, а иногда и получить представление о структуре, применяя для этой цели физический и химический анализы вирусных компонентов и рентгеноструктурный анализ вирусов. С помощью этих методов удается даже «заглянуть» внутрь объекта исследования, получить представление и о трехмерной структуре вирусов.
Форма живых организмов в природе является главным признаком, необходимым для систематизации. В состав ботаники и зоологии входят специальные научные разделы, носящие название «морфология». Эта наука о закономерностях строения (буквально — «учение о форме») помогает и вирусологам. Большинство исследователей считают, что обитателей «хаоса» следует классифицировать по морфологическим признакам.
Найти и не сломать! С невидимыми врагами, от которых многие века не было спасения ни людям, ни животным, ни растениям, ученые обращаются так «нежно» и осторожно, как будто они работают с тончайшими стеклянными елочными игрушками. И действительно задача «выделить» вирус из обломков клеток похожа на задание «вытащить стеклянные шарики из кучи различных игрушек, в том числе и железных, не прикасаясь к ним». Разумеется, шарики должны остаться целыми, сохранить свою форму.
Трудность в том, что к каждому вирусу требуется свой подход. Метод, найденный для вирионов сферической формы, может не подойти для палочковидных вирионов. В процессе очистки препарата вируса условия обработки не должны повредить вирусные частицы.
Методы выделения. Среди методов выделения растительных вирусов самым быстрым является метод погружения. Край листа отрезают и место среза погружают на 1 — 2 с в каплю дистиллированной воды, помещенную на мельчайшую сетку с целлулоидной пленкой. Некоторая часть вирионов вымывается этой каплей из растения, капля высыхает, и вирусные частицы оказываются на пленке. Теперь их остается только закрепить и контрастировать. Однако в каплю воды попадает сок растения, а это значит, что при высыхании рядом с вирусными частицами может оказаться множество посторонних белковых частиц, похожих на вирусы.
Конечно, ученые стремятся получить препарат как можно более чистый. Удовлетворяется это стремление за счет усложнения методов и комбинирования различных приемов. Дифференциальное центрифугирование, о котором сообщалось ранее, с успехом применяется в тех случаях, когда вирионы заметно отличаются по величине от клеточных компонентов. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы позволяет разделить частицы, незначительно отличающиеся друг от друга.
Из больших объемов жидкостей вирус лучше выделять методами высаливания или осаждения в изоэлектрической точке. Иногда вирусы поглощаются смолами.
Бактерии и другие крупные частицы можно уловить путем фильтрования через специальные фильтры из инфузорной земли, фарфора, асбеста, которые задерживают частицы размером не менее 0,5 мкм (1 мкм = ИГ4 см). Вирусы, размеры которых составляют от 0,01 до 0,3 мк (от 100 до 3000А), почти всегда проходят через бактериальные фильтры, но в распоряжении ученых есть и ультрафильтры (например, нитроцеллюлозные мембраны), которые могут задержать и вирус. С помощью таких мембран определяют размеры вирусных частиц даже тогда, когда вирионов очень мало. Для этого необходимо «просеять» вирусы последовательно через ряд мемб-
ран с порами разной величины, заметить фильтр, задерживающий наибольшее количество частиц, и измерить диаметр пор.
Некоторые способы измерения. Легко сказать «измерить». Чтобы выполнить этот эксперимент (впрочем, как и многие другие), биологу не обойтись без основательного знания физики. Ведь диаметр пор рассчитывают по величине давления, при котором продавливаются в воде через мембрану пузырьки воздуха или продавливают с определенной скоростью воду через мембрану. А частицы, которые могут пройти через поры, в 1,25 раза меньше диаметра пор.
Явление диффузии тоже служит делу измерения вирионов. Условия для диффузии создают специально, заливая послойно раствор с вирусными частицами и раствор с определенной молекулярной средой. Частицы в полном соответствии с законами физики стремятся проникнуть в среду, и остается только, зная температуру (Т), площадь контакта сред и изменение концентрации в единицу времени, подсчитать коэффициент диффузии (D). А зная этот коэффициент, не трудно вычислить радиус частицы, имеющей сферическую форму: , где R — газовая постоянная, N — число Авогадро, Л — вязкость среды.
Сложнее обстоят дела с несферическими частицами. Поскольку коэффициент диффузии в таком случае зависит сразу от трех размеров, приходится добывать дополнительные данные. Так, помещая пробирку в центрифугу, изменяют условие диффузии. Частицы отбрасываются от оси вращения, одновременно усиливается и их диффузия в противоположную сторону. В момент равновесия массу вирионов можно определить по их концентрации в двух различных точках пробирки. А затем при определенных допущениях можно рассчитать и размеры.
Для определения концентрации частиц и их раз-
меров служит свет. Измерив интенсивность света, рассеиваемого в растворе, можно установить именно эти характеристики. Причем по тому, как изменяется количество света, рассеянного под разными углами, можно рассчитать даже степень асимметрии удлиненных вирусов.
Однородность по форме и величине. Каждый знает, что обитатели животного и растительного мира бывают в младенческом возрасте, что они более или менее быстро растут, изменяют свои размеры, а иногда и форму и наконец достигают зрелого возраста. Так и должно быть, потому что клетки, из которых состоят все живые организмы, растут. Популяция клеток (совокупность клеток одного и того же вида), растущих в обычных условиях, содержит клетки различных размеров, которые находятся в различной стадии развития.
В популяции вирионов определенного типа все частицы, точнее их оболочки, называемые к а п с и -д а м и, имеют одинаковые размеры и форму. Однородность по форме и величине создает впечатление, будто вирионы сходят с конвейера крошечного завода. Приглядевшись к вирусам, можно заметить, что они «собраны» из компонентов, как здание, построенное из одинаковых кирпичиков, причем в полном соответствии с принципами геометрии. В результате электронно-микроскопических исследований было установлено, что природа создала два геометрических типа капсидов — спиральные и кубические (изометрические или квазисферические). Правда, тип оболочки вирионов не всегда бывает виден. Подобно зданию, окруженному высокими деревьями, капсиды бывают окружены еще одной оболочкой, которая образуется на последней стадии роста вируса. Но, разумеется, исследователям удается «проникнуть» и под внешнюю оболочку, и даже внутрь капсид. Рассмотрим сначала форму вирионов.
Вирусы со спиральными капсидами. Спиральная симметрия характерна тем, что после полного оборота вокруг оси вращения фигура занимает исходное положение. Большинство вирусов, поражающих растения и многие бактерии, имеют спиральный тип симметрии. Примером такого вируса может служить вирус табачной мозаики (ВТМ). При взгляде издалека, при сравнительно небольшом увеличении, ВТМ похож на палочки.
Палочки ВТМ и некоторых других вирусов довольно жесткие и видны на микрофотографиях всегда прямыми. Средняя длина палочек ВТМ составляет 3000А, толщина — 150 — 170А.
Электронная микрофотография частиц аденовируса. Капсид имеет икосаэдрическую форму. От вершин отходят нитевидные отростки.
Электронная микрофотография частицы вируса герпеса.
К группе палочковидных вирусов относятся также Х-вирус картофеля (длина 515А), вирус желтухи свеклы (длина — 1250А). Шаг спирали у таких вирионов в 1,5 раза больше шага спирали ВТМ.
Вирусы с изометрическими капсидами. Фигуры с кубической симметрией имеют три оси вращения (октаэдры, тетраэдры, икосаэдры). Таким типом симметрии обладают многие вирусы человека и животных — вирус полиомиелита, вирус ящура и др. При первом рассмотрении вирионы кажутся шарообразными, однако при детальном изучении это правильные многогранники: округлые или призматические, сплошные или полые, гладкие или с отростками.
Примерами вирусов с изометрическими капсидами могут служить: вирус желтой мозаики турнепса (ВЖМТ), вирус герпеса, аденовирус.
Электронная микрофотография частицы вируса гриппа. Капсиды не имеют строго определенной формы. Оболочка покрыта множеством шипов. Внутренний компонент свернут кольцами.
является вирус-сателлит. Он имеет форму многогранника, а диаметр его составляет около 180А.
Сложные капсиды. Имеются среди вирусов и такие, которые отличаются более сложными геометрическими формами. Так, частицы вируса мозаики люцерны (BMЛ) выглядят в виде уменьшенных бацилл. Вирусы гриппа и парагриппа имеют сердцевину в виде спирали. Но еще более сложные капсиды имеют некоторые бактериофаги (вирусы бактерий).
Гигантом среди вирусов выглядит вирус оспы. Вирионы вируса оспы, вируса кантагиозного пустулезного дерматита и некоторых других вирусов имеют сложные внешние оболочки, под которыми скрываются внутренние элементы. Следует отметить, что чем сложнее устроены вирионы, тем у них больше вероятность отклонения от «стандартной» формы потому, что возрастает возможное число ошибок при возникновении новых частиц вирусов. В таких случаях, например, в популяциях шарообразных вирионов можно наблюдать нитевидные или эллипсоидные капсиды.
Как заглянуть под оболочку вируса? Мы только что указали, что в состав вирионов входят нуклеиновые кислоты. Такое высказывание естественно, если допустить, что вирусы обладают признаками жизни. Именно нуклеиновые кислоты природа создала для хранения, реализации и передачи наследственной информации, т. е. для тех действий, без которых невозможно воспроизводство вирусов.
Трудно было найти способы сделать вирусы видимыми. Одной из главных задач вирусологов, пытающихся определить форму вирионов, является очистка препарата от посторонних частиц. Эта задача имеет еще большее значение при изучении компонентов вирусов, находящихся под оболочкой. Необходимо было не только выделить вирусы, но и разрушить их оболочки и отделить вирусную нуклеиновую кислоту от белка, липидов и других примесей, встречающихся в препарате вируса. Разумеется, бессмысленно и думать о том, чтобы найти и тем более захватить и выделить из микроскопически малых обломков вируса микроскопически малые цепочки нуклеиновых кислот. Для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и рибонуклеиновой кислоты (РНК) применяют сложные физико-химические методы, многие из которых позволяют получить в свободном состоянии не разрушенные, обладающие инфекционностью препараты. Первыми, кому удалось получить «живую» нуклеиновую кислоту вируса табачной мозаики, были немецкие ученые А. Гирер и Г. Шрамм, обработавшие вирусный препарат фенолом. Фенол активно воздействует на белок, изменяя его свойства, в результате чего белок легко отделяется от РНК путем центрифугирования. Так как этот метод не является универсальным и не эффективен для подготовки к исследованию других вирусов, были разработаны такие приемы, как нагревание в разбавленном солевом растворе, обработка гуанидином, уксусной кислотой, додецилсульфатом натрия и сульфатом аммония. А для выделения нуклеиновых кислот из некоторых вирусов применяются даже смешанные методы.
Странный характер наследственного вещества. Все обитатели животного и растительного мира состоят из клеток (или хотя бы из одной). Нуклеиновые кислоты впервые были выделены из ядра, а позже были обнаружены и в других местах клетки. Поэтому мы вкратце остановимся на тех функциях, которые выполняют нуклеиновые кислоты в клетках, на их значении в живых организмах.
При делении живых клеток нуклеиновые кислоты обеспечивают синтез белков дочерних клеток той же структуры и того же состава, что были и у материнской клетки. Каждый вид организма содержит специфические нуклеиновые кислоты.
Известно два типа нуклеиновых кислот: ДНК и РНК. ДНК находится в ядре клетки, а также в небольших количествах в митохондриях и хлоропла-стах. РНК встречается преимущественно в цитоплазме. ДНК и РНК по структуре являются полимерами, состоящими из нуклеотидов, которые соединены в своеобразные цепочки. Однако молекула ДНК состоит не из одной, как молекула РНК, а из двух спирально закрученных одна вокруг другой цепей суммарной шириной 20А. Длина ДНК может достигать сотен мкм.
Не вдаваясь в подробности строения нуклеиновых кислот, состава и механизма сцепления нуклеотидов, процесса удвоения (редуплекации), отметим, что отрезок ДНК считается элементарной единицей наследственности — геном. Совокупность генов содержит информацию обо всех особенностях организма, а каждый ген определяет строение одного из белков живой клетки. Наследственность всех организмов на Земле закодирована в последовательности нуклеотидов генов. Что касается РНК, то они участвуют в синтезе белков и в зависимости от выполняемой функции или от места нахождения делятся на транспортные, информационные, рибосомальные. Так распределились роли двух типов нуклеиновых кислот во всем органическом мире. Причем клетки всех обитателей этого мира — от примитивных бактерий (микоплазмы, риккетсии) и амебы до высших растений и человека — всегда содержат две цепочки ДНК и одну цепочку РНК.
Однако результаты многочисленных исследований химического состава и строения вирусов показали, что вирион всегда содержит нуклеиновую кислоту только одного типа. И что самое странное, вирусы благополучно существуют и с одной цепочкой ДНК, и, более того, большая группа вирусов (рибовирусов) содержит только РНК (одну или две цепочки).
Проблемы классификации. Без знания места, которое занимает объект исследования в ряду ему подобных, ученым трудно работать. Классификация — группирование объектов по общим признакам — нужна в первую очередь для того, чтобы экономить время, силы и средства, чтобы, раскрыв тайны одного вируса или разработав меры борьбы с каким-либо вирусным заболеванием, применить на других, подобных вирусах и болезнях.
Частые открытия в вирусологии, бурно развивающейся науке, вынуждают пересматривать законы и свойства, по которым сгруппированы вирусы. В основу самой простой классификации положены объекты, которые поражаются вирусами: существуют бактериофаги (вирусы, поражающие бактерии), вирусы простейших, вирусы растений, вирусы животных. В свою очередь они делятся на группы. Например, вирусы животных разделяются на вирусы человека, вирусы приматов, вирусы грызунов и т. п. Условность этой классификации очевидна — многие вирусы могут поражать несколько видов хозяев.
Классифицируют вирусы и по симптомам (признакам) тех болезней, которые они вызывают. Врачам и ветеринарам удобно группировать вместе вирусы респираторных заболеваний, вызывающих заболевания дыхательных путей; вирусы энцефалитов; виру-
сы лихорадок и т. д. Однако известно, что разнородные вирусы могут вызывать сходные симптомы, а один и тот же вирус может быть причиной разных форм болезни.
Результаты исследований химического состава и строения вирусов использованы для более точной научной классификации. Подразделяются вирусы на группы в зависимости от природы нуклеиновой кислоты: дезоксивирусы (содержат ДНК) и рибовирусы (содержат РНК). В группах имеются подгруппы, соответствующие типам капсидов: вирусы с изометрическими (кубическими), вирусы со спиральными или вирусы со смешанными капсидами. В свою очередь вирусы в подгруппах отличаются еще и по наличию или отсутствию внешней оболочки. Такая классификация позволяет однозначно определить место каждого вируса (если он достаточно изучен) на основе важнейшей характеристики организмов — нуклеиновых кислот.
Предложенные классификации основаны на ограниченном числе признаков. Вирусы существенно различаются по многим свойствам, важным в тех или иных условиях. Так, для борьбы с вирусными инфекциями большое значение имеет классификация по степени чувствительности к определенным химическим веществам, к нагреванию, к кислотности среды. Вирусы обладают различной способностью размножаться в развивающихся куриных эмбрионах, в членистоногих переносчиках или в ядре и цитоплазме.
Ученые не считают какую-либо классификацию вирусов единственно верной и законченной. Конечно, будут еще обнаружены новые свойства, которые уточнят и расширят таблицу вирусов, а может быть, и позволят создать новую классификацию.
KOHEЦ ФPAГMEHTA КНИГИ
|
